在密度梯度液中用速度-区带和等密度离心法纯化细胞、亚细胞器、病毒和生物大分子是生物医学研究最通用的技术手段。常用的角转头、水平转头在分离时受到转头容量及管壁效应的影响，旋转密封区带转头则需要旋转密封附件，操作困难，且会漏液。而重定向梯度区带转头可以在转头停止哐在转动过程中加入密度梯度溶液和被分离的样品，在转头停止时取样，不需要旋转密封附件，操作灵活方便，为生物样品的提取提供一种重要途径。本文探讨该转头的工作特点及应用。
1 重定向梯度区带转头的工作特点
在旋转密封区带转头的工作过程中，转头大约以3000-5000r/min运转时，给转头安装密封附件，再通过梯度泵加入梯度介质。当离心结束时，转头减速到同样转速，梯度泵再泵入高浓度的液体，从中心孔导管收集分离的样品。而重定向梯度区带转头与旋转密封区带转头的不同点在于该转头的底部具有不对称的V-形槽，用可拆装的轴核/隔板把转头分隔成扇行室。密度梯度液和被分离的样品可以通过蠕动泵从V-形槽收集。这样，该转头就能进行动态和静态加载，但必须是静态卸载。其特点如下：
1.1 静态加载 离心前，转头处于停止状态，用蠕动泵通过分配器给转头按次序加入表层样品层、密度梯度液和垫衬层，直至加满整个转头，也可以只加入密度梯度液和垫衬层。然后，拆掉蠕动泵管道，用慢加速控制器或在重定向方式中缓慢加速转头。转头在加速过程中，由于重力和离心力的共同作用，梯度发生重新定向，离心力和重力的比值随转速和梯度距转轴间的距离成正比。所以，等浓度层面形成抛物面，焦点在轴上。当转速很高时（大约800r/min），等浓度面几乎成为以轴为中心的同心圆。梯度由原来的垂直分布转变为径向分布。
1.2 动态加载 动态加载方式与旋转密封区带转头的装载方式类似。但在重定向转头中是先加入垫衬层，再加入密度梯层液、样品和表层。在这种方式中先把转头加速到一定转速，蠕动泵通过分配器把密度梯度溶液导入通液道，在离心力的作用下进入转头，在动态加载中，不存在密度重定向问题。
1.3 加入样品的方式 给重定向转头国呆，可以用蠕动泵，也可以用注射器或滴管。可以是动态加样也可以是静态加样。一般采用以下三种方式：①在静态加载中，制备密度梯度溶液后，用注射器或滴管把样品均匀地铺放在梯度顶部。加样量一般为15-20ml。②在动态加载中，转头加速到一定转速（大约1000到2500r/min之间）梯度由原来的垂直分布转变成径向分丰后，用蠕动泵给转头加入样品，流速在1~100ml/min范围内，也可用注射器加入。在静态加载中，加入密度梯度液后，立即加入样品。③根据被分离样品的特性，样品可以铺放在梯度中的任何位置。例如，血浆脂蛋白就铺放在垫衬层的上面，梯度的下面，离心过程中脂蛋白通过梯度分层。
1.4 取样方式 在旋转密封区带转头中，转头减速到一定转速（A型转头在400-500r/min、B型转头在3000-5000r/min），加入梯度取代液，这一过程一般需要30-60分钟，在此过程中，一些大颗粒如整细胞、细胞核、叶绿体、线粒体等会继续沉降，引起区带加宽。非在重定向梯度区带转中，样品颗粒分离后，转头减速到1000r/min以下时，不用制动器，转头缓慢降速，直到停止。梯度及分离的颗粒由径向分布再次转变成垂直分布后，连接蠕动泵管道，按照减小沉降速度或减小密度的顺序从转头中抽出梯度液，分别收集已分离的颗粒进行分析。
2 常用的重定向样度区带转头
常用的重定向梯度区带转头有SZ-14和TZ-28两种，它们有相同的大小及工作方式，不同之处在于SZ-14是铝合金而TZ-28是钛合金转头。他们的分离特性如表1所示。另外改良的旋转密封区带转头也可以采用重定向工作方式。例如B-XV转头和Klucis改良的B-XXV转头等。
表1 TZ-28和SZ-14转头的技术指标
|
|
ST-14 |
TZ-28 |
|
最大速度 |
19500r/min |
28000r/min |
|
相对离心力（RFC） |
|
|
|
在R最小（3.65cm） |
15530 |
32000 |
|
在R最大（9.53cm） |
40550 |
83400 |
|
总容量 |
1350ml |
1350ml |
|
直径 |
21.33cm |
21.33cm |
|
材料 |
铝合金 |
钛合金 |
3 重定向梯度区带转头在生物医学中的应用
重定向梯度区带转头是一种特殊类型的区带转头，在选择离心方法时应权衡各种影响因素，首先应考虑被分离颗粒的大小和密度，其次还应考虑转头的分离特性和离心机能够到达的转速等来选择使用等密度离心法或速率-区带离心法。表2是重定向梯度区带转头的具体应用。
表2 重定向转头的一些应用实例
|
样品 |
转头型号 |
梯度材料及形状 |
离心状态 |
|
肿瘤细胞 |
SZ-14 |
3.2-7.5%线性Ficoll
(M,W400000)梯度 |
1030r/min
4℃ 10分钟 |
|
人血细胞 |
SZ-14 |
4-8%线性Ficoll梯度 |
1000r/min,
4℃ 10分钟 |
|
乙型肝炎抗原 |
SZ-14 |
10-42%线性蔗糖梯度 |
2500r/min |
|
肝细胞 |
TZ-28 |
2.7-16%线性Ficoll梯度 |
500r/min,2-4℃
10分钟 |
|
血浆脂蛋白 |
TZ-28 |
阶梯梯度 |
28000r/min 4℃
21分钟 |
|
线粒体 |
SZ-14 |
14.5-45%线性蔗糖梯度 |
7600gav,0-2℃,
11分钟 |
用重定向梯度区带转头分离线粒体进可以把全部匀浆加在梯度上，不会象差速离心那样在沉降细胞核时丢失部分线粒体。一次离心可以使纯化的线粒体基本上得到全部回收，提高了回收率的和纯度。最近，用TZ-28转头从用致癌因子饲料喂养的老鼠肝脏中分离出肝细胞，细胞在2.7%-16%（w/w）线性Ficoll梯度上4℃，500r/min离心10分钟。
在旋转密封区带转头中分离亚细胞器时，通过动态加样需要一定时间（3-10min）。那么先加入的颗粒比后加入的沉降早。同样，取样过程一般也需要30-60分钟。在这些过程中，一些特别大的颗粒继续宙降的现象变得非常明显。在重定向梯度区带转头中，样品几乎同时沉降。转头停止后再取样，所以不会引起区带加宽的现象。这种方法在分离细胞时特别有用。
用重定向转头分离，有以下特点：①不需要复杂的的旋转密封附件；②由于是静态加样，并且转头加速速率很慢，所以，可以应用非常粘的梯度介质；③转头容量大，可以大规模地分离细胞，细胞核，叶绿体，线粒体，高尔基体，溶酶体，过氧化物酶体，质膜，核蛋白体，糖原等；④由于在单位重力场下取样，克服了在旋转密封区带转头中取样时颗粒继续沉降的现象；⑤不需要用高浓度的梯度取代液取代转头中分离的样品；⑥不通过旋转密封器，所以DNA等不会由于外切力的影响引起链的断裂。
