[摘要] 沉降分析技术是表征大分子及其相互作用的一种行之有效的实验技术．被广泛应用于地方病实验研究中。本文简要介绍了沉降分析技术的应用。通过沉降平衡实验分析大分子的流体动力学非理想性，沉降速度实验测定在强离心力场下溶液中大分子的行为，从中获得的数据经过拟合分析，包括Van Holde—weischet全分界面拟合、Stafford时间导数法等。用来分析大分子的组装、拆卸，大体构型和构型改变，大分子—大分子、大分子—小分子相互作用，缔合特性等。
[关键词] 沉降平衡；沉降速度；大分子；地方病
均匀大分子溶液处于强离心力场下，当大分子的浮力密度大于悬浮介质的密度时，大分子就会向离心池底部移动，其速度与它的分子量、分子构形、大分子与介质间的密度差、粘滞阻力、离心场强度等因素有关。在非相互作用的二组分系统，大分子在离心池中移动形成仅含溶剂的上清液区，浓度均一的大分子溶液区(该区称为坪区)，以及上清液与坪区之间的过渡区(transition region)，叫做沉降分界面。但当所加的离心力不是太大，大分子的沉降作用将与反方向的扩散作用保持动态平衡，在离心池中形成大分子溶液的浓度梯度。实际上，沉降分析就是对沉降分界面和平衡梯度进行分析，沉降分界面和平衡梯度中包含有大量有关生物大分子的信息，对其深入研究将是揭开有关生命活动的一把钥匙。
早在1923年，Svedberg为了研究胶体颗粒的特性，研制出带有光学系统的离心机，用来观察速度沉降分界面，建立厂测量蛋白质分子量的沉降扩散法；1925年又用沉降平衡法测定了马血红蛋白的分子量(67 000)，并得出一重要结论，蛋白质是一种具有均一大小的大分子。同一时期，用渗透压、端基分析、粘度等方法证明了大分子的存在，揭开了大分子研究的序幕。1929年，Lamm结合沉降系数和扩散系数用流的概念概述了沉降过程中的质量守恒偏微分方程，它是全分界面分析的基础；1962年，Fujita在若干假定条件下，求得了Lamm方程的近似解，适合于研究分子量大于10 000daltoll的大分子；2002年，Behlke在Fujita解的基础上．增加参量求得了全分界面分析的近似解，通过单次实验可同时
确定沉降系数、扩散系数，用于研究诸如血管紧张素这样的小肽分子的轴比、分子量、分子长度、体积等参数。1958年，Meselson和Stahl通过14N、15N同位素标记，用等密度法建立的大肠杆菌DNA半保留复制规律，为分子生物学研究奠定了基础。还有许多科学家如Yphantls教授在沉降平衡研究方面的杰出工作，Van Holde和weischet建立的外推法测定S的整体分布，Stafford建立的时间导数法对扫描曲线的转换等都对不均一与相互作用大分子系统的研究发挥了巨大作用。当今沉降分析法已用于研究生物大分子的分子量、大小及分布、纯度、大体构型、流体动力学非理想性(包括Viral系数、活度系数)、自身缔合的平衡常数、配体—受体结合、大分子复合物的稳定性、自装配的机制、大分子与小分子相互作用、大分子与大分子相互作用等方面的研。沉降分析技术是表征大分子及其相互作用的一种行之有效的实验技术，被广泛应用于地方病实验研究中．本文简要介绍了沉降分析技术的应用。
l 、 大分子组装、拆卸及稳定性的研究
大分子的沉降系数(s)对其大小和形状的改变异常敏感，当大分子组装和拆卸时，其大小、构型、结合的紧密程度等均发生明显改变，实际上沉降速度法是用来观察这种变化最为理想的方法，并且可用来识别复杂大分子组装和拆卸的作用过程。最近Ignacio等(2002)用这一方法研究了ATP合成酶亚单位C环的自组装，Mendoza等研究了泡影蛋白Cpn60的自组装，Vondervisit等(1996)研究了鞭毛HAP-2的自组装等。通过研究揭示了大分子的组装特性和影响组装过程的因素，为进一步研究和探讨分子组装的机制及为研究细胞器的组装打下了基础。在研究组装的同时，若加入不稳定剂或解离剂，通过测定S分布可清楚地判断有否分离的中间体产生，可用来研究大分于的解离过程，还可确定协同解离过程的程度。
2、大分子构型的流体动力学分析
既使普遍应用高分辨率的核磁共振(NMR)、X—射线衍射(XRD)技术研究大分子构型，但用流体动力学的方法分析大分子构型仍然非常重要，其主要理由是有些大分子结晶体不一定能代表它的天然构型，而动力学方法具有不需结晶的优点，通过沉降分界面的分析直接得到大分子的沉降系数，它与沉降分子和介质问的摩擦系数有关，因此提供了一种随悬浮介质改变而改变大分子沉降特性的一种灵敏方法，如果知道分子量(M)，结合沉降系数等就可估算沉降分子的有效半径。对于球形分子，摩擦系数之比f／fo=1，比值高表明分子的不对称性和轴比大．Ausio(2000)对核小体的结构分析表明，它是高度紧密的核蛋白复合物，摩擦系数之比f／fo=1.1，接近于球形，也测出了它的Stokes半径为40A，是第一个由实验证实核小体的球形构造．Calponin在调节平滑肌收缩过程中起重要作用，通过沉降平衡分析测得其单体的分子量为(31．4±1．0)kDa，与根据氨基酸组成计算的分子量32.3 kDa基本上是一致的，沉降速度法测得Calponin的S20，W是2．34 s，结合蛋白质的水化度及偏比容，把Calponin按扁长椭球来处理，计算得轴比为6．16，长度16.2nm，直径2．6 nm，与电子显微镜测得的结果一致。
3 、活性酶离心
该技术是区带离心技术的扩展，它是在形成活性酶—底物复合物催化过程中研究酶促反应。把纯化的酶装入合成区带离心槽里，扇形离心池里含有底物缓冲液，离心时，由于酶区带迁移催化底物形成产物，通过光学系统检测底物的消失或产物的生成来观察酶区带的移动。绘制出半径的自然对数Inr与时间t间的关系曲线，其斜率可表达具有催化作用酶的流体动力学特性。结合转头速度，米氏常数等参数常用两种方法对实验数据进行处理，一种是中点法，即用区带中点来代表整个区带的迁移，但误差较大；另一种是精确法，它结合整个催化时程进行全分界面分析，可同时计算沉降系数，扩散系数等参数，但计算过程复杂。脱氢酶系，如谷氨酸脱氢酶是该方法最成功的应用例证，经多种模拟技术验证，表明所得的结果是可靠的。该技术的突出优点是它直接测定活性酶催化形式的流体动力学特性，而不是测定具有不同活性的酶蛋白，假若缓冲液中的成份不改变酶的沉降特性，它还可以确定不纯混合物中单独酶成份的流体动力学特性，比常规酶活性测定法具有许多优点。
4 、蛋白质自身缔合的研究
实际上沉降平衡技术是研究蛋白质自身缔合的首选方法，无沦是分析超速离心机还是制备超速离心机都可用于研究自身缔合。通过测量缔合分子与非缔合分子在离心场中的径向分布，将浓度用半径的函数表示，分别求得重均分子量MW．数均分子量Mn和Z均分子量MZ。实验中，通过在不同初始浓度下测量分子总浓度与半径的函数关系，求得自身缔合的分子量、化学计量、平衡常数等。有两种方法用来对自身缔合系统进行分析，一种是Milthorpe等建立的Omega函数，该方法避免了计算表现分子量(Mapp)的繁杂过程。由于Ω(r)是总浓度C(r)的函数，当浓度C(r)→0时，就得到将Ω(r)外推到无限稀释时的Ωo值，它能够用半径的函数计算活度系数a1。另一种方法是Yphantis实验室建立的NONLIN分析法，它对沉降平衡数据进行综合非线性最小二乘法拟合，该方法可以用来测量溶液中大分子的分子量，自身缔合系统中的缔合常数、化学计量、非理想系数。其中含有n聚物中的Cmonomer，Mmonomer和Ka等参量．该方面研究应用的例子很多，但应用制备超速离心机研究用125I标记的胰岛素的沉降平衡行为具有很多优点，它可在低于100倍浓度下通过分级分离后测定。测得单体的分子量是5600，增大总胰岛素浓度重均分子量增加，重均分子量与单体分子量之比是总胰岛素浓度的函数。但应用分析超速离心机具有获取数据快速、准确等优点。Nourse和Jeffrey(1998)用沉降平衡法通过Ω函数分析了鸭嘴兽胰岛素、获得了大量有关自身缔合的信息，其中包括在加入与不加入Zn2+时的缔合平衡常数。
5 、 大分子相互作用的研究
当大分子发生相互作用时，它们的流体动力学特性会发生改变，表现为S值和重均分子量分布的变化。事实上沉降法早已用于这方面的研究，无论是沉降速度法还是沉降平衡法对这种相互作用都提供了严格的判定标准。这方面的研究涉及抗原—抗体结合，蛋白水解酶与相应蛋白质类抑制剂的结合，酶分子与酶分子结合形成多酶，蛋白质类激素与相应受体结合等众多反应。沉降法可在相当宽的浓度范围内获得精确的热力学数据．以揭示相互作用的因果关系。该类相互作用大致分为两种主要类型，首先，如果大分子是与小分子配体相互作用，并且小分子配体的量足够大，通过高速沉降弯月面处大分子-配体复合物认为已经耗尽，弯月面处配体的浓度代表反应体系在平衡时游离配体的浓度，按照S分布及重均分子量对数据进行处理。该方法已用于14C—CTP结合到天冬氨酸氨甲酰转移酶、5’-AMP结合到胰核糖核酸酶等的特性分析。另一种情况是大分子与大分子之间的相互作用，在这种情况下除形成的复合物产生沉降外，大分子配体也在离心场中重新分布，在研究这类相互作用前．要单独研究各自大分子的沉降特性，再通过测定整个溶液的浓度分布来表征大分子间的亲和特性。Liu等用沉降速度法研究了人IgE与抗IgE抗体的相互作用，他们用IgE高亲和受体SFC?I作为竞争剂来探测，lgE与IgE单克隆抗体的相互作用，由于SFC?RI比rhumAbE25小很多，根据沉降速度可区别IgE—SFC?RI和IgE·rhuMAbE25形成的复合物。通过研究复合物的迁移特性，能够区别rhuMAbE25与其它类似的单克隆抗体的结合活性。
生物大分子的相互作用，特别是蛋白质·蛋白质相互作用，蛋白质—核酸相互作用是生化调节多样性的基础，沉降速度法直接测量大分子的沉降系数，进而确定大分子的构型、缔合常数等参数，沉降平衡法是测量分子量及其分布最为理想的方法。它们在地方病的研究中越来越具有明显的优势。近年来，分析超速离心机在数据获得及分析软件方面取得了长足进展，结合Van Holde的外推法，Stafford的时间导数法及I amm方程更加祥尽的近似解，使应用研究范围进一步扩展。但沉降分析法在国内由于种种原因还未普遍应用，我们相信分析超速离心技术在研究生物大分子特性以及在揭示生命奥秘中会发挥更加重要的作用。
