摘要 用结核菌素注射冷冻和保存精液其方法简单方便，易于推广。该方法除需要培养基外，仅需要1个液氮容器、10小筒及液氮即可。它较之常用的安瓿、麦杆管或球型器冷存法有冷冻前操作程序少、无需解冻后操作及可选择的人工授精方式多的优点。这种冷存法冷存的精液质量类似麦杆管法，其精子生存力和授精力可与麦杆管、球型器、安瓿法媲美。
1776年Spaiianzani报告，冷冻于雪中的精子可以存活。1866年Mantegazza发现，在-15℃下冷冻较长时间的精液解冻后，部分精子可恢复活动。因此他推测，可用冷冻保存的精子为阵亡士兵的遗孀作人工授精。1937年Jannel偶然观察到，在-79℃、-196℃和-269℃下，部分人体精子可以存活。最初人们试图改善超低温下保存精子的方法，但未成功。在一偶然情况下，有人发现，甘油具有冷冻保护作用，于是出现了奇迹。Bunge和 Sherman以甘油作为冷冻保护剂，用冷冻保存精液为3位妇女成功地进行了人工授精。
到目前为止，已有许多关于改善冷冻保存人体精液的报告。在这些报告中，均采用液化氮，含蛋黄培养基以及甘油。采用含蛋黄培养基已很普遍，但其优点也受到怀疑。最近，蛋黄游离培养基的应用获得成功。冷冻精液可保存于安瓿，麦杆管或球型器中，三种保存形式都需要在冷冻前和解冻后的多次操作程序。本文介绍使用结核菌素注射器冷冻和保存精液。由于注射器可在人工授精时使用，故仅需部分冷冻前的操作程序 而无需解冻后的操作。
材料和方法
精液标本取自正常供精者和不育夫妇男方精子正常者。液化后精液与改良Mahadevan冷冻保护培养基混合，该培养基含NaCl 100mM；KCl5.37mM；MgSO4 0.49mM；NaH2PO2H2O 0.32mM;NaHCO3 3095mM；乳酸钙2.46mM；蔗糖50.00mM；甘氨酸133.33mM；葡萄糖5.56mM;HEPES(二羟基二次乙基乙胺乙烷碳酸)20.00mM；甘油2054.00mM和人血浆白蛋白4gm/L。除甘油和人血浆白蛋白外，其余溶剂应被溶解于500ml的蒸馏水中。边搅拦溶液边逐滴加入甘油，最后再逐渐加入人血浆白蛋白。用1N NaOH将pH调整至7.0。再加入双蒸馏水使培养基总量为1升。培养基中甘油的最后浓度为7.5%（wt/vol）。培养基被滤过消毒后，分送于无菌塑料管中加盖，在-20℃下保存。
用10厘米长的结核菌素注射器抽入部分精液冷冻保护培养基的混合液，再用一带针帽的细针或椎形封闭器严密封闭。为防止解冻时封闭物脱落，在注射器内吸入1ml空气，从而允许注射器内容物在解冻时膨胀。用颜色标记注射器的管心部位后，即置注射器于一小筒内，再直接放入贮存液氮的容器中。解冻时，为减少封闭器脱落，先将注射器在室温下放置1分钟，然后再置于温水（25-30℃）5分钟解冻后擦干注射器以防水进入授精套管内。
剩余的精液-冷冻保护培养基混合液被抽入0.2ml的法国麦杆管中。用密闭粉封口后，置麦杆管于小筒中，在缓慢降入液氮容器内的液体之前，先置于稍高于液氮面的液氮蒸气中保留10分钟。解冻时麦杆管置于室温下5分钟即可。
分别用常规检查、精子穿透试验和仓鼠卵试验测定冷冻前和解冻后的精子活动力、穿透宫颈粘液能力及授精能力。新鲜和冷冻精液的精卵共同孵育时间是3小时为了比较新鲜精子和注射器冷冻精子在体内的生活力，在用供精者精液授精后46~50内作了6例授精后试验（PITs），只有在人工授精日和PIT日的宫颈粘液是正常者方可接受试验。对受试者，每周期交替采用新鲜和冷冻精液。
对用注射器保存的精子与新鲜精子在体内的生育力进行比较。18名妇女每周期接受2次人工授精，2次授精之间间隔1~2天，每位妇女接受同一供精者精液，并按组当月交替采用新鲜和冷冻精液，9人先采用新鲜精液，另9人先用冷冻精液。采用新鲜精液的为24周期，冷冻精液的为22周期。
结果
加入冷冻保护剂并不影响精子活动力，而冷冻和解冻过程使活动精子百分数降低，但不影响精子活动度，冷存于注射器的精液与冷存于麦杆管的结果类似。加入冷冻保护剂，冷冻、解冻过程可不同程度的影响体外精子穿靛宫颈粘液的能力，但用注射器或麦杆管冷存的精液结果并无显著差异。
于1和2号病人观察到，2小时后冷冻精液在精子穿透计上的穿透密度较新新鲜精液为低，但未见精子活动度的改变。注射器和麦杆管之间，2小时后宫颈粘液中的解冻后精子活动度无差异。1份宫颈粘液中的解冻后精子活动度无差异。1份宫颈粘液对精子明显出现了对抗性，但4号病人的精子并未发现异常。仓鼠卵试验表明：采用冷冻精子，具有抗凝精子头的仓鼠卵百分数减少，但两种冷存方法之间无差异。
采用新鲜精液的10个PITs中的9个和用注射器冷存精液的9个PITs中的5个在人工授精后2天显示出精子前运动。
交替接受新鲜精液和冷冻精液的18人中13人在9周期内妊娠，用新鲜精液的8人于一周期内妊娠，而用冷存精液的5人也在一周期内受孕。
讨论
结果表明 ：注射器人与麦杆管内的冷存精液质量类似。采用结核菌素注射器冷存精液比用麦杆管、球型器或安瓿有以下优点。1、用小于1ml的容器充填和封闭注射器操作非常简单。2、由于注射器可降入液化氮的液体部分，无需在液氮蒸气的前孵育，从而简化了冷冻过程，大概因为注射器后相对较厚，足以延缓冷冻率。3、解冻后的注射器内精液可被直接用于阴道内、宫颈内低处、宫颈内高处、子宫内和宫颈帽授精。而麦杆管内精液只适用阴道内和低位宫颈内授精。注射器的缺点是其在冷存容器中所占空间大于麦杆管、球型器或安瓿。作者以前的一些实验结果提示：注射器冷存精子在体内生存力和达到妊娠机会可与用其它方法冷存的精子相媲美。故认为：用结核菌素注射器的人精液冷冻保护法特别适于少量供精人工授精的医生使用，这种冷存方法除需培养基外，仅需有1个液氮容器大约35L和10个小筒以及液氮即可。精液制备可在10分钟完成，注射器内精液的解冻仅需5分钟，也许胚胎冷冻保存也可用结核菌素注射器进行。
